第7回 患者が行く！研究室訪問 ～大阪大学大学院医学系研究科 宮川周士先生～ （前編）

第7回目となる今回は、糖尿病治療用遺伝子改変ブタの開発について大阪大学で研究をされている宮川周士先生にお話をうかがいました。

宮川先生の研究内容については研究概要書をご覧ください。

なお、本事業は大塚商会ハートフル基金の助成を受けて開催することができました。

目次

宮川先生からのメッセージ

研究室訪問（前編）

異種移植の研究について（なぜブタの細胞を用いるのか）

大阪大学医学系研究科准教授の宮川周士です。私の研究の最終目標は「バイオ人工臓器の開発」です。当面の試金石として「バイオ人工膵島」を中心に研究しています。

ブタの膵島とそのインスリンはヒトに移植してほぼ完璧に機能するのが、他の動物からの移植よりも魅力あるポイントと考えます。

まず、なぜヒトとブタのインスリンにフォーカスするか、ヒトとブタのインスリンはどう違うかについてお話しします。

ブタもヒトも膵臓のランゲルハンス島（＝膵島、インスリン分泌細胞）によってインスリンが合成されます。遺伝子情報をもとにアミノ酸が合成され、そのアミノ酸が多数結合してプロ・プレ・インスリンが作られます。その後３箇所で切れて末端部のA鎖と中心部のB鎖が合わさり、インスリンとして働きます。インスリンはタンパク質なので、アミノ酸が多数つながって鎖のようになっています。ヒトのインスリンのA鎖のアミノ酸は末端が「T」で、ブタでは「A」に置き換わっているという違いしかありません。なので、インスリンとして働く部分には関係ないため、ブタのインスリンはヒトの体でほぼ問題なく作用します。現在、治療用に使われているインスリンは全て最後が「T」で終わるヒト型のインスリンですが、私が医者として働いていた若い頃は製薬企業でヒトのインスリンが作れず、ブタのインスリンを治療に使っていました。

次に、ヒトからヒトへの移植はなぜ普及しないのかについてお話します。

先進国というより世界中でひどくドナーが不足しているのが現状です。さらに日本ではなかなかドナーが現れないということです。

異種移植には系統的にヒトに近い動物であるサルを用いたものと、全く異なる異種を使ったものがあります。サルはヒトに対し臓器のサイズが小さく、病気も詳細が不明で共通感染症の問題があり移植に使えません。また、サルは生まれてから子どもを産むまで10年ほどかかり移植動物としては成長のサイクルが長すぎます。ブタは妊娠して114日前後で子どもが生まれ、6～8ヵ月で大人になり、子どもを産める状態になります。１回の出産でおよそ8頭、多い品種では10数頭ほど生れて、その子が親になりさらに子を産みます。同じ親から数年で数10頭、さらにその子供からも1、2年後に100頭という単位で増え続けます。そういう点からもブタが移植用の動物として条件を満たします。また、ブタは1万年ほど前から家畜として飼育され世界中（イスラム圏以外）で食べられていることから、動物の病気についてもヒト、マウス、ラットの次によく知られています。これらのことから、異種移植用の動物としてはブタを使うようになりました。

臨床での異種移植は各国が独自に行なうのではなく、国際機関WHOが管理して報告しています。詳細は省きますが、どの国で臨床を行ったかはWHOのサイト（英語版）で調べることができます。既にかなりの数、行われています。

異種移植研究の背景

異種移植の軌跡 発生工学

異種移植の軌跡で述べたいことは「発生工学」です。

1980年にマウスの遺伝子をハンドリングする技術ができました。マウスの卵（受精卵）にマウスの遺伝子や異種の遺伝子を導入する技術で、目的とした遺伝子をもったマウスが作出できます。そのマウスをトランスジェニックマウスと呼びます。このトランスジェニックマウスの技術が確立後、おおくの動物に遺伝子を入れることが可能になりました。

次に、1989年にカペッキらが特定のマウスの遺伝子をつぶす技術を開発し、ノックアウト（特定の遺伝子を働かなくさせること）マウスができました。彼らは後にノーベル賞を受賞しています。次の核移植の話は、あの有名になったクローン羊のドリーの話です。スコットランドでドリーというクローン羊が生まれました。これはいったん分化した細胞（この時は乳腺細胞）から核を取り出して受精卵の核と入れ換え、「一旦分化した細胞は元には戻らない」という常識を覆し、大きな遺伝子＝核を入れ換える技術です。

さらに2009年ジンクフィンガー法、2010年ターレン法、2012年クリスパー法でノックアウト細胞、および動物が簡単にできるようになりました。私が大阪大学の微生物病研究所にいる頃、細胞の特定遺伝子を潰すことは大変な事でした。

ノックアウトマウス技術ができた1989年以後も実際には作り出す事は大変でしたが、新しいクリスパー法は、石で火を起こしていたのがマッチをシュッとこすれば火が起きる…それほど簡単な方法です。

我々も以前の方法でα-gal（アルファギャル）という糖鎖抗原を作り出す遺伝子をブタでノックアウトしました。実際はこの「ノックアウトブタ」を作出するのには長い時間がかかりました。以前の方法では、まず潰したい部分の遺伝子と相同の遺伝子且つそれに傷をつけた遺伝子と線維芽細胞（線維芽細胞：組織を構成する細胞の1つ）を混ぜて一定の電気を細胞に通します。すると間違って傷のついた相同遺伝子が核まで流れ込み、正常の遺伝子と組み換えを起こします。確率的に１/100万、あるいは１/1000万しか遺伝子組み換えは起こりません。

ところがクリスパー法は、Cas9と呼ばれる特殊な酵素と、標的とする遺伝子の配列と引っ付くガイドRNAというものを利用して遺伝子を潰すやり方で、１/10個とはいいませんが非常に高い確率でノックアウトがおこります。以前の方法では、１回ノックアウトした核を核移植して、胎児で遺伝子や染色体を調べ、もう１回正常と思われる胎児の線維芽細胞の核を核移植してやっと生れて来ます。とにかく時間がかかります。従って、成功したのは日本では我々だけ、世界でも4、5ヵ所しかありません。

異種移植に欠かせない免疫のはたらき

宮川研究室訪問の様子1

免疫反応についてお話される宮川先生

 

次に、少しだけ免疫の話をします。

免疫=身体のプロテクション（保護）のことです。NK(ナチュラルキラー)細胞、T細胞、マクロファージ、B細胞（抗体を作る細胞）などの免疫細胞が関係します。血液凝固作用も、免疫機構ではないですが関係しています。あらゆる免疫機構は移植したブタの臓器や細胞を拒絶しようとします。サルにブタの心臓グラフトやバイパス用血管を植えると、何もしていない（野性型）ブタからのグラフトは数十分すると真っ黒になります。

ヒトの免疫機構は異物に反応し拒絶反応が強くないと生きていけません。膵島もブタからそのまま取って移植すると、先ほどの心臓と同じような拒絶反応がおこります。第一関門として、ヒトの体内には血液、水分中にたくさんの免疫タンパク質（＝補体）があります。極端な表現ですがこのタンパク質はある意味「毒」です。ヒトの細胞はヒト補体制御因子と呼ばれるシールドがあるため、問題ありません。ところがブタの細胞はヒト補体制御因子を持っていないので、異物としてヒトの免疫機構が働き、この補体が真っ先にブタの細胞をやっつけます。ヒトの身体は補体と補体制御因子の関係で守られているのです。ところがブタの細胞にヒトの補体制御因子があれば、異物として攻撃されません。

ヒトとサルはα-galの遺伝子をもっていませんが、他のあらゆる動物はもっています。そして、ヒトはα-galに対して抗体を自然抗体として持っています。

自然抗体の例としては血液型があります。A型、O型の人はB型の血液を輸血すると、まず自然抗体が反応し、次に血液が凝固してしまうため、輸血できません。生まれつき、他の血液型に対する抗体をもっているのです。

異種移植でα-galの次に問題になる糖の抗原（＝生物体内で抗体を形成・出現させる物質）は「HD抗原」といわれ、チンパンジーにはありますがヒトだけはもっていません。これらの糖鎖抗原に対して「どうしたらいいか、どう対応したらいいか」ですが、それはそれらの遺伝子をノックアウトすればいいのです。ブタはα-galもHD抗原もありヒトの身体に入れるとα-galとHD抗原に対する抗体が働いて真っ黒に拒絶反応を起こします。補体も抗体も共同の作業でブタのグラフトをやっつけます。一方、ヒトはそれらの抗原を持っていなくても生きていますから、ブタでもこれらの遺伝子を欠損しても大丈夫だろうということで、ノックアウトしたブタが作られました。

ヒトのNK細胞には、自分の細胞か否か＝攻撃すべきか否かをチェックする機構があります。有名なのはHLAという、ほぼすべての細胞と体液に分布しているヒトの組織適合性抗原です。ヒトのNK細胞は組織適合性抗原が本人と一緒であれば攻撃せず、違っていれば攻撃します。そのため、ヒトの組織適合抗原の遺伝子をブタに発現させれば、NK細胞が間違ってヒトと判断し攻撃されません。

白血球の一種で体内の清掃屋の役割を果たすマクロファージの制御法も同じです。CD47というタンパク質をヒト型のものに変えます。その他の細胞も、自己非自己を判断するタンパク質をヒト型のものに変えればこれらの細胞の攻撃を受けません。免疫細胞から攻撃を受けないようにするために、こういう様々な分子（遺伝子）を考え出すのが我々のやっている研究です。

異種移植の際の拒絶反応を制御するために、ヒトの免疫機構がブタの細胞や臓器をどういうメカニズムでやっつけるか解析し、対応策を研究しています。補体には補体制御因子、血液凝固に対して抗凝固因子、糖鎖抗原に関しては糖鎖遺伝子を見つけてノックアウトします。NK細胞やマクロファージは前に述べた通り、ヒト型の遺伝子を入れることで反応を抑えます。とてつもない作業ですが、１つずつ解析を進め、各免疫側のファクターを避けていけばいいのです。

世界でのブタの遺伝子改変プロジェクト

世界でのプロジェクト

ブタの膵島移植の臨床例としてLiving Cell Technologies社(以下LCT社)というニュージーランドの会社が、ニュージーランド、ロシア、アルゼンチンを入れ、既に40例近い臨床例を行っています。これはブタの膵島を取り出してゲルで囲み、（食用の人工イクラに使われているのと同じような膜、等に入れて、）ヒトの身体に移植するものですが、移植したゲルが十分持たないのが今後の課題となっています。

このような事情もあり、一方ではブタの遺伝子改変プロジェクトは世界中で取組まれています。アメリカはシステムがよく、ハーバート大学やピッツバーグ大学、アラバマ大で実施されています。同時期に5～６ヵ所に大きな予算を与えます。1施設で年間３億円x５年の資金です。一方、日本では現在資金援助は微々たる額です。大きなお金は下りません。これまでにイタリアやドイツでは資金が下り、さらにヨーロッパ連合（EU）からも下りています。逆に、イタリアは宗教上の理由もありローマ法王が替わったことでサルを実験に使えなくなりました。一方、ドイツでは研究が続き、国家プロジェクトとして国から資金や必要なものが支給され、しっかりしたシステムで取組まれています。

現在までに、様々な遺伝子改変ブタの研究が各国で競争され、各国ともサルに移植した遺伝子改変ブタのグラフトがどのくらい生着するかを競い、細かなデータを学会で発表しています。

日本でのプロジェクト

我々は大阪大学と明治大学で共同研究でを行っております。オーストラリアへ行き、トランスジェニックやその他のブタを使う技術を学び、現在では明治大学農学部の教授をされております長嶋先生と長年に渡って共同研究を行っています。これまでには我々にも資金がおり、α—galをノックアウトし補体制御因子を入れた遺伝子改変ブタを作り出しております。またα—galとH-D抗原を同時にノックアウトした特殊なブタを作りました（2014年）

日本では政府が異種移植よりも再生治療への関心が高く、各大学とも異種移植研究の資金が続きませんでした。研究を進めるグループは減っていき、実際にブタを作る研究をしているグループは、今は大阪大学＝明治大学しかありません。

基本的に大阪大学＝明治大学で連絡を取り合って、基礎研究を進め、阪大で合成した「ブターヒト間の免疫応答制御に世界的に有効とされる基本的な遺伝子」や、「過去の我々の研究から出た、一部特許のかかっている遺伝子」、さらに、「有効性を確認し、一部を組み替えた理、ハイブリッド化した遺伝子」を明治大学へ送ります。明治大学には色々な種類のブタの細胞があり、それに遺伝子を入れて核を取り出しブタの卵細胞に核移植をして新たなブタを作っています。この工程には資金がかかります。2006年までの10年間は幸いに国からの助成を受けて研究をすすめる事が出来ましたました。しかし現在では研究費は桁が一桁下がり、研究を進めていくのが難しいのが現状です。

ブタに導入する遺伝子の作成

宮川研究室訪問の様子2遺伝子をつくる時、ヒトの遺伝子を導入した大腸菌を培養し、中からプラスミド（大腸菌などの細菌や酵母の核外に存在し、細胞分裂によって娘細胞へ引き継がれるDNA分子の総称）を抽出します。最近は市販のカラムで抽出に取り組んでいます。ブタに導入する予定の遺伝子は時に大きいもので、なんども遺伝子組換えを行わないと出来上がりません。その度に大腸菌を利用して選択・増幅を繰り返し、思い通りの配列になっているかをチェックしています。この工程を永遠と繰り返しております。

バイオ人工膵島移植の実現に向けて

現在、京都府立大学の井上先生にも、明治大学との共同研究に参加して頂いております。ブタの感染状態のスクリーニングです。一方、国立国際医療研究センターではバイオ人工膵島の臨床開始に取組んでいただけるという事です。すでにIDDMからの巨額の寄付を受けて特殊な部署を立上げられましたので、そこを見学させていただきました。

2014年には所謂「再生新法」で異種の細胞移植が認められました。また、一昨年の2016年、「異種移植のガイドライン」が改定されました。これで既に臨床的な法律面で、ブタ膵島に関しては一応問題なく、あとは無菌に近いブタ（＝DPFブタ：考えられる支障ある病気にかかっていないブタ）をつくることと、その施設が問題となりす。この研究では「どうやって、考えられる人体に支障ある病気にかかっていないブタを作りだすか」が重要となりました。簡単に言うと、DPFブタは、出産の際に帝王切開行って作ります。ブタの子どもは子宮の中では原則無菌です。この状態を保つことでDPFブタを作れることが、長嶋先生との研究で分かりました。実際にできたDPFブタのガイドラインの感染症チェック項目はものすごい数に上りますが、そのうち何十％かは日本ではありえない、（世界中の事例を羅列しているので何十％は有り得ない）専門家から見て「いらない」という部分を除外して、感染の検査体制の準備が京都府立大学でほぼできて来ています。日本IDDMネットワークの基金から助成をいただいた研究は順調に進んでいます。

日本で研究を行うことの意義

遺伝子改変ブタに関する研究が行われているのは大阪大学と明治大学だけなので、我々がやめると日本で研究・開発しているグループが無くなります。

しかし、例えば、韓国は３つ４つに分かれたグループが遺伝子改変ブタの開発に切磋琢磨しています。現在でも彼らの研究開発資資金は日本のそれと比べ物にならないほど豊富で、国が大量に援助しています。このままでは、この分野の医療では、アメリカ、ドイツだけでなく韓国にもおそらく、日本は遅れることになります。中国にも？

膵島も「簡単に再生できない細胞」ですが、一方DMとは話は離れますが、血液透析をされて日本で腎臓ドナーを待っている人は、何を待ったらいいのでしょうか。考えられるのは、「世界で段違いに少ないヒトからの腎臓」「いつになるかまったく先の見えない再生医療で作り出された腎臓」そして「ブタのバイオ人工腎臓」のいずれかになります。つまり、バイオ人工臓器・細胞がいかに大切か見えてくると思います。

一方、バイオブタが使えるようになった時に膵島移植でも腎臓移植でも日本では仮に1000万円かかるとすると、アメリカだと300万円、韓国は500万円で済みます。彼らは自国開発です。日本でのこの金額の差は外国の企業がもって行くことになります。例えば研究用試薬は薬品関連会社から直接・間接的に買えますが、各国で値段が違います。日本で特殊な試薬を買えば1万円かかるものが、現地アメリカでは30ドルと1/3程度です。C型肝炎の治療薬が良い例です。

何としても国民のこの損失を阻止するために、この基礎研究への資金援助が難しい日本で頑張っています。さらに言いますと、一つの先端分野で大きな遅れをとると関連する分野にも大きく影響することになります。

 

（後編へ続く）